HemoHIM, preparado a base de hierbas diseñado para la recuperación del sistema inmunológico. Investigamos el efecto antiinflamatorio de HemoHIM en un modelo de ratón con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) inducida por el humo del cigarrillo (CS) y los lipopolisacáridos (LPS). Para inducir la EPOC, se expusieron ratones C57BL/6 a CS durante 1 h por día (ocho cigarrillos por día) durante 4 semanas y recibieron LPS por vía intranasal el día 26. Se administró HemoHIM a ratones en una dosis de 50 o 100 mg/kg 1 h. antes de la exposición al CS. HemoHIM redujo el recuento de células inflamatorias y los niveles de receptor del factor de necrosis tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-6 e IL-1β en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) inducido por la exposición a CS+LPS. HemoHIM disminuyó la infiltración de células inflamatorias en las vías respiratorias e inhibió la expresión de iNOS y MMP-9 y la fosforilación de Erk en tejido pulmonar expuesto a CS+LPS. En resumen, nuestros resultados indican que HemoHIM inhibió una reducción en la respuesta inflamatoria pulmonar en la inflamación pulmonar inducida por CS y LPS a través de la vía de Erk. Por lo tanto, sugerimos que HemoHIM tiene el potencial de tratar enfermedades inflamatorias pulmonares como la EPOC.
La prevalencia de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) ha aumentado constantemente debido al aumento de la población fumadora y la exposición a diversas sustancias químicas [ 1 ]. A medida que aumenta la EPOC, el costo del tratamiento también aumenta y la calidad de vida disminuye [ 2 ]. La EPOC se caracteriza por inflamación de las vías respiratorias, secreción de moco y enfisema que resultan en una reducción de la función pulmonar [ 3 , 4 ]. Por lo tanto, muchos investigadores han investigado el remedio para suprimir eficazmente el desarrollo de la EPOC.
Se sabe que el humo del cigarrillo (CS) es el mayor factor de riesgo relacionado con el desarrollo de EPOC [ 5 ]. CS induce continuamente inflamación de las vías respiratorias mediada por vías de señalización complejas porque consta de miles de sustancias químicas tóxicas [ 6 ]. Producen especies reactivas de oxígeno (ROS), interleucinas, quimiocinas y proteasas mediante la estimulación directa o indirecta de las células epiteliales de las vías respiratorias y los macrófagos [ 7 ]. La elevación del índice de inflamación provoca inflamación crónica de las vías respiratorias y alteraciones estructurales que ejercen la pérdida de la función pulmonar [ 8 ]. Según documentos anteriores, la supresión de las respuestas inflamatorias se considera una estrategia de tratamiento importante para inhibir el desarrollo de la EPOC.
Las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK) son una de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) y un mediador importante en la actividad transcripcional celular, incluidas las respuestas inflamatorias [ 9 ]. La vía ERK se activa mediante diversos estímulos y CS es un poderoso estímulo para la activación de ERK [ 10 ]. Durante el desarrollo de la EPOC, la activación de ERK produjo citoquinas proinflamatorias, como el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-1β e IL-6 y metaloproteinasas de matriz (MMP), que agravan la inflamación de las vías respiratorias y destruyen las vías alveolares normales. estructura [ 11 , 12 , 13 ].
HemoHIM, una preparación a base de hierbas está diseñada para recuperar el sistema inmunológico y se utiliza comercialmente en Corea del Sur. Consta de tres hierbas; Angelica Radix, Cnidium Rhizoma y Paeonia Radix [ 14 ]. Se ha informado que HemoHIM mejora el sistema inmunológico en pacientes sometidos a quimioterapia y tiene un efecto antiinflamatorio en el edema de la pata inducido por carragenina, regula a la baja las respuestas inmunes similares a Th1 en ratones irradiados con rayos γ fraccionados y tiene un efecto antidiabético en una estreptozotocina. modelo diabético inducido [ 15 , 16 , 17 , 18 ]. Sin embargo, no se ha realizado un estudio sobre los efectos protectores de HemoHIM sobre la inflamación pulmonar inducida por la exposición a CS y LPS.
Por lo tanto, examinamos la respuesta antiinflamatoria de HemoHIM en el pulmón utilizando un modelo inducido por CS y LPS. Para confirmar el posible mecanismo de HemoHIM, investigamos la expresión y producción de mediadores inflamatorios pulmonares debido a la exposición a CS y LPS.
Materiales y métodos
animales
Se adquirieron ratones C57BL/6N machos libres de patógenos específicos (20 ~ 25 g, de seis a ocho semanas de edad) de Samtako Co. (Osan, Corea). Fueron alojados en grupos de nueve en condiciones estándar (temperatura 22 ± 2 ℃, humedad 55 ± 5 %, ciclo de luz/oscuridad de 12 h) con comida y agua. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Nacional de Chonnam.
Inducción de CS y LPS en ratones C57BL/6 y administración de fármacos
El CS se generó a partir del cigarrillo de investigación 3R4F (cigarrillo de referencia de Kentuchy, Universidad de Kentuchy, EE. UU.), que contenía 11,0 mg de partículas totales, 9,4 mg de alquitrán y 0,76 mg de nicotina por cigarrillo. La exposición a CS (una bocanada/min, 35 ml de volumen de bocanada durante 2 segundos, cada 60 segundos, 8 cigarrillos por día) se realizó utilizando un generador de humo de cigarrillos (Daehan Biolink, República de Corea). Los ratones fueron expuestos a CS durante 1 h en una cámara (50 cm x 30 cm x 30 cm) durante 28 días. Se instilaron LPS por vía intranasal (10 µg disueltos en 50 µl de agua destilada) bajo anestesia el día 26. El HemoHIM se obtuvo del Instituto Coreano de Medicina Oriental (Daejeon, República de Corea). Se administró HemoHIM a ratones en dosis de 50 o 100 mg/kg mediante sonda oral 1 h antes de la exposición al CS durante 28 días. A un grupo de control positivo se le administró roflumilast (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, EE. UU., 10 mg/kg), que es un inhibidor de la PDE-4 y se fabrica para el tratamiento de la EPOC.
Colección de líquido de lavado broncoalveolar (BALF)
Cuarenta y ocho horas después de la última administración intranasal de LPS, los ratones fueron sacrificados mediante una inyección intraperitoneal de zoletil 50 (25 mg/kg; Virbac korea. Co., Seúl, Corea), y se realizó una traqueotomía según un estudio previo [ 19 ]. Para obtener el líquido de lavado broncoalveolar (BALF), se infundió PBS helado (0,7 ml) en el pulmón y se extrajo mediante canulación traqueal. Este proceso se repitió una vez (volumen total 1,4 ml). Para determinar los recuentos celulares diferenciales, se centrifugaron 100 µl de BALF en portaobjetos utilizando un Cytospin (Hanil Science Industrial, Seúl, Corea). Los portaobjetos se secaron y las células se fijaron y tiñeron utilizando el reactivo de tinción Diff-Quik (B4132-1A; IMEB Inc., Deerfield, IL) según las instrucciones del fabricante. El sobrenadante obtenido del BALF se almacenó a -70 ℃ para análisis bioquímico.
Medición del mediador proinflamatorio en BALF.
Los mediadores proinflamatorios en BALF se midieron utilizando kits ELISA (R&D System, Minneapolis, MN, EE. UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las placas se incubaron durante 10 minutos en la oscuridad y la absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, Laboratories).
inmunotransferencia
El tejido pulmonar se homogeneizó (1/10 p/v) usando un homogeneizador en un reactivo de lisis/extracción de tejidos (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, EE. UU.) que contenía un cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich). Las concentraciones de proteínas se determinaron utilizando el reactivo de Bradford (Bio-Rad). Se resolvieron cantidades iguales de proteína total (30 µg) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con una solución de bloqueo (5 % de leche desnatada) seguido de una incubación durante la noche a 4 ℃ con el anticuerpo primario apropiado. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios y diluciones: anti-β-actina (dilución 1:2000; Cell Signaling, Danvers, MA, EE. UU.), anti-pERK (dilución 1:1000; Cell Signaling), anti-ERK (1:1000 dilución; señalización celular) y anti-iNOS (dilución 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, MA, EE. UU.). Las transferencias se lavaron tres veces con solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 (TBST) y luego se incubaron con una dilución 1:10000 de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, EE. UU.) durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, las transferencias se lavaron tres veces con TBST y luego se revelaron utilizando un kit de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, EE. UU.).
Zimografía de gelatina
La zimografía SDSPAGE se realizó según un estudio previo (Shin et al., 2014) para determinar la actividad de la gelatinasa. Brevemente, se utilizaron como sustrato de MMP geles de zimograma compuestos por 10% de SDS-PAGE que contenían 1% de gelatina. Los geles se lavaron en Triton X-100 al 2,5 % durante 1 h para eliminar el SDS y luego se incubaron a 37 ℃ durante 16 h en tampón de desarrollo (Tris-HCl 1 M, pH 7,5 con CaCl 2 ). Posteriormente, los geles se tiñeron con 25% de metanol/8% de ácido acético que contenía Coomassie Brilliant Blue. La actividad de la gelatinasa se visualizó como bandas blancas sobre un fondo azul que representaban las áreas de proteólisis.
Histopatología del tejido pulmonar.
El tejido pulmonar se fijó en paraformaldehído al 4% (v/v), se embebió en parafina, se seccionó con un espesor de 4 µm y se tiñó con hematoxilina y eosina (Solución H&E; Sigma-Aldrich) para estimar la inflamación.
Los portaobjetos inmunohistoquímicos se desparafinaron, se deshidrataron, se lavaron en PBS que contenía tween 20 al 0,05% (PBS-T) y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente con suero de cabra para bloquear la tinción inespecífica. Los portaobjetos se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con anticuerpo primario de ratón anti-MMP-9 de ratón (diluido 1:100, Abcam). Después de la incubación, se lavaron tres veces, se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario biotinilado y luego se incubaron con un complejo de avidinbiotina-peroxidasa (Vector Laboratories, Burlin-game, CA, EE. UU.) durante 1 h a temperatura ambiente. Luego, los portaobjetos se lavaron con PBS-T y se incubaron con diaminobencidina (DAB, Abcam) durante 5 minutos más.
análisis estadístico
Los datos se expresan como medias ± desviación estándar (DE). La significación estadística se determinó mediante un análisis de varianza (ANOVA) seguido de una prueba de comparación múltiple con ajuste de Dunnet. Los valores de p <0,05 se consideraron significativos.
Resultados
HemoHim reduce la cantidad de células inflamatorias en BALF inducidas por la exposición a CS y LPS
La cantidad de células inflamatorias en BALF aumentó en ratones expuestos a CS y LPS en comparación con los ratones de control con vehículo. Específicamente, la exposición a CS y LPS aumentó notablemente la cantidad de neutrófilos en BALF en comparación con el control. Sin embargo, en los ratones tratados con HemoHim, el número de neutrófilos en BALF disminuyó de manera dosis dependiente en comparación con los ratones expuestos a CS y LPS (Figura 1).
HemoHim disminuye las citocinas proinflamatorias inducidas por la exposición a CS y LPS
En ratones expuestos a CS y LPS, los niveles de TNF-α en BALF aumentaron significativamente en comparación con los ratones de control con vehículo (Figura 2A). Roflumilast redujo significativamente el TNF-α en ratones expuestos a CS y LPS. Además, los ratones tratados con HemoHim mostraron una disminución dependiente de la dosis de TNF-α en comparación con los ratones expuestos a CS y LPS. Los resultados de IL-6 e IL-1β en BALF fueron similares a los de TNF-α (Figura 2A, B). Los ratones expuestos a CS y LPS aumentaron significativamente el nivel de IL-6 e IL-1β en BALF en comparación con los ratones de control con vehículo, y los ratones tratados con HemoHim disminuyeron significativamente el nivel de IL-6 e IL-1β en BALF en ratones expuestos a CS y LPS.
HemoHim reduce la expresión de iNOS y la fosforilación de Erk en tejido pulmonar inducida por la exposición a CS y LPS
La expresión de iNOS aumentó en el tejido pulmonar de ratones expuestos a CS y LPS en comparación con los ratones de control con vehículo. Los ratones tratados con roflumilast disminuyeron notablemente la expresión de iNOS en el tejido pulmonar en comparación con los ratones expuestos a CS y LPS. Además, los ratones tratados con HemoHIM mostraron una disminución dependiente de la dosis de la expresión de iNOS en el tejido pulmonar en comparación con los ratones expuestos a CS y LPS (Figura 3A).
En comparación con los ratones de control con vehículo, la fosforilación de Erk aumentó significativamente en los ratones expuestos a CS y LPS. HemoHIM disminuyó marcadamente y de manera dependiente de la dosis la fosforilación de Erk en ratones expuestos a CS y LPS (Figura 3B).
HemoHim disminuye las respuestas inflamatorias en el tejido pulmonar inducidas por la exposición a CS y LPS
Los ratones expuestos a CS y LPS exhibieron una extensa infiltración de células inflamatorias en el tejido pulmonar (Figura 4). Células inflamatorias que se acumulan principalmente en lesiones peribronquiales y alveolares. Por el contrario, los ratones tratados con roflumilast redujeron la infiltración de células inflamatorias en el tejido pulmonar inducida por la exposición al CS y al LPS. De manera similar, la infiltración de células inflamatorias se redujo significativamente de manera dependiente de la dosis en los ratones tratados con HemoHim en comparación con los ratones expuestos a CS y LPS.
HemoHim reduce la expresión y actividad de MMP-9 en el tejido pulmonar inducida por la exposición a CS y LPS
La expresión de MMP-9 en el tejido pulmonar aumentó notablemente en ratones expuestos a CS y LPS en comparación con los ratones de control con vehículo (Figura 5A). Sin embargo, los ratones tratados con HemoHim redujeron este aumento de expresión de MMP-9 en el tejido pulmonar inducido por la exposición a CS y LPS. En zimógrafos, los ratones expuestos a CS y LPS mostraron un marcado aumento en la actividad de MMP-9 en comparación con los ratones de control con vehículo, mientras que los ratones tratados con HemoHim exhibieron una reducción marcada y dependiente de la dosis en la actividad de MMP-9 en comparación con los ratones expuestos a CS y LPS (Figura 5B).
Discusión
HemoHIM se utiliza para superar los efectos secundarios de la quimioterapia en pacientes con cáncer. Estudios recientes han informado que HemoHIM posee efectos antiinflamatorios, antioxidantes y antidiabéticos. En este estudio, investigamos los efectos de HemoHIM en modelos de inflamación de las vías respiratorias expuestas a CS y LPS. HemoHIM suprime notablemente el aumento del recuento de células inflamatorias y de citoquinas proinflamatorias en BALF inducido por la exposición a CS y LPS, lo que estuvo acompañado por una reducción de la infiltración de células inflamatorias en el tejido pulmonar como se observa en la histopatología. Además, HemoHIM disminuyó profundamente la fosforilación de Erk y la expresión de MMP-9 e iNOS en el tejido pulmonar de ratones expuestos a CS y LPS.
El humo del cigarrillo (CS) es un factor de riesgo importante para el desarrollo de EPOC, que conduce a una inflamación de las vías respiratorias asociada con neutrófilos y macrófagos en las vías respiratorias [ 20 , 21 ]. Estas células produjeron citocinas, quimiocinas y proteasas proinflamatorias que agravan la inflamación de las vías respiratorias, la secreción de moco y la alteración estructural [ 22 ]. Las citocinas proinflamatorias, TNF-α, IL-6 e IL-1β participaron en la destrucción del parénquima mediante la liberación de proteinasa y requirieron remodelación de las vías respiratorias mediante la regulación positiva de MMP-9 en modelos in vitro e in vivo inducidos por CS [ 23 , 24 , 25 ]. Por lo tanto, la inhibición de las citocinas proinflamatorias es importante para atenuar la inflamación de las vías respiratorias inducida por CS y LPS.
En este estudio, los ratones expuestos a CS y LPS mostraron aumentos marcados en el recuento de células inflamatorias, TNF-α, IL-6 e IL-1β en BALF en comparación con los controles. Sin embargo, los ratones tratados con HemoHIM mostraron una reducción significativa en estos factores fisiopatológicos en comparación con los ratones expuestos a CS y LPS. Además, estos eventos estuvieron acompañados de la reducción de la alteración histopatológica del tejido pulmonar. Los ratones expuestos a CS y LPS mostraron una infiltración extensa de células inflamatorias en el tejido pulmonar, mientras que los ratones tratados con HemoHim mostraron una reducción en la alteración histopatológica inducida por la exposición a CS y LPS. Según estos resultados, HemoHIM puede tener un efecto antiinflamatorio sobre la inflamación de las vías respiratorias mediada por la exposición al CS.
ERK es un factor de transcripción MAPK y desempeña un papel clave en la expresión de diversos genes inflamatorios como MMP-9 e iNOS [ 19 , 26 ]. Estudios anteriores han demostrado un aumento en ERK con MMP-9 en modelos de ratones inducidos por CS y LPS y células estimuladas por condensado de CS [ 19 ]. CS estimuló la fosforilación de Erk en células epiteliales de las vías respiratorias, macrófagos y neutrófilos, lo que eventualmente eleva la expresión de MMP-9 e iNOS [ 19 , 27 ].
MMP-9 participa en las respuestas inflamatorias de las vías respiratorias y en la destrucción del tejido pulmonar normal mediante la degradación del colágeno y la gelatina. iNOS se asocia con el inicio y el agravamiento de la inflamación de las vías respiratorias a través de la elevación de la producción de óxido nítrico en la inflamación de las vías respiratorias inducida por CS [ 10 , 28 ]. Esta señalización se observó en ensayos clínicos de EPOC. Los pacientes con EPOC aumentaron la fosforilación de la expresión de Erk, MMP-9 e iNOS en el esputo y el lavado [ 28 , 29 , 30 , 31 ]. Nuestros resultados muestran que los ratones expuestos a CS y LPS aumentaron la fosforilación de ERK con una expresión elevada de MMP-9 e iNOS en su tejido pulmonar en comparación con los controles. Sin embargo, los ratones tratados con HemoHim mostraron una marcada reducción en la fosforilación de Erk con disminuciones en la expresión de MMP-9 e iNOS en el tejido pulmonar en comparación con los ratones expuestos a CS y LPS. Estos resultados sugieren que los efectos terapéuticos de HemoHIM sobre la inflamación de las vías respiratorias expuestas a CS y LPS están estrechamente asociados con una reducción en la expresión de MMP-9 e iNOS mediante la supresión de la fosforilación de Erk en el tejido pulmonar expuesto a CS y LPS.
En conclusión, evaluamos los efectos antiinflamatorios de HemoHIM sobre la inflamación de las vías respiratorias inducida por la exposición a CS y LPS. HemoHIM redujo significativamente las células inflamatorias y las citocinas proinflamatorias en BALF inducidas por la exposición a CS y LPS. HemoHIM disminuyó la expresión elevada de iNOS y MMP-9 inducida por la exposición a CS y LPS en el tejido pulmonar. Estos efectos pueden estar relacionados con la inhibición de la fosforilación de ERK. Por lo tanto, nuestro estudio sugiere que HemoHIM tiene el potencial de tratar enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias, como la EPOC inducida por la exposición al CS.
Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura (número de subvención: NRF-016R1C1B2008818).
Notas a pie de página
Conflicto de intereses: Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses económicos para publicar estos resultados.
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